灰狼简称狼，属于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬属(Canis)文爱 x，由于狼食谱宽、顺应性强，曾在地球上正常散布[1]。狼在我国曾一度散布于除海南省、南中国海诸岛屿以及台湾省外的广地面区，但由于东谈主为捕杀和生境阻碍，现仅王人集散布于东谈主口较为零星的内蒙古、新疆、青海、西藏等地区[2]。我国对于狼的筹商主要王人集在宏不雅生态学方面，对于狼种群遗传万般性及系统分类地位的筹商卓越少，何况在狼亚种的辩别上还存在着稠密争议：许多学者以为中国狼或蒙古狼(Canis lupus Chanco)与欧亚狼(Canis lupus Lupus)是并吞个亚种[3]；中国动物志引述Pocock等和Ellerman 等的筹谈论断以为散布于中国境内的狼仅有蒙古狼(C. l. chanco)一个亚种[4， 5]；王秀辉应用RAPAD体式将中国狼辩别为5个亚种：云贵和东南集群亚种，东北河北群体亚种、甘肃群体亚种、内蒙古群体亚种和新疆群体亚种[6]；罗理杨等通过测定中国各个地区狼线粒体铁心区部分序列得出散布于青海、西藏、云南的狼种群属于西南种群亚种，东北种群与华北种群算作一个亚种，内蒙古及新疆种群包摄不成笃定[7]。国内对狼遗传万般性的筹商未见报谈，这对于野生狼种群的处理及保护卓越不利。

线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)不会发生遗传重组，较核DNA有更高的突变率，因此被公以为用来算作筹商动物遗传进化的标识物资[8]。线粒体细胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)基因全长浅显在1100—1200 bp之间，何况不同物种间序列长度各别较大，可是在核苷酸构成上却具有偏好性。由于Cyt b基因中含有突变和保守区，何况存在较慢和较快的进化的密码子位点，是以Cyt b基因是对动物系统进化筹商的较好的分子标识。犬科动物线粒体铁心区(Control region displacement loop，D-loop)全长1240—1360 bp，其中存在3个保守序列框(Conserved sequence block)：CSB Ⅰ、CSB Ⅱ和CSB Ⅲ[9]。肇端位点位于CSB Ⅰ区5′端的第一高变区(Hypervariable region，HVR Ⅰ)序列变异速度较快，常被用来进行种群遗传结构及系统地舆分析[10]。近些年来，保护生物学筹商如故长远到分子水平，要求使用分子本质时期从多半动物样本中索要DNA以获取动物的遗传信息。在相聚分析样品的流程中，传统的取样体式(通过杀死动物来获取极新的组织或拿获动物抽取血液)对于旷野动物种群突出是濒危零星动物种群较难罢了。因此本筹商相聚了来自青海、新疆及内蒙、吉林4个地区55个样品，且多数样品接受非毁伤取样的体式赢得。通过分子生物学技能胜利赢得44个个体线粒体D-Loop区HVR Ⅰ序列和40个线粒体Cyt b部分序列，对其进行遗传学分析，探讨各地种群遗传万般性盘曲并分析其系统进化地位。

1 材料与体式 1.1 样品相聚

本筹商于2011年12月至2012年6月分别在青新疆阿勒泰地区、内蒙古西旗、内蒙古达赉湖当然保护区、吉林图门市共相聚样品55份，且样品多数来自于旷野捕捉的圈养狼(样本细心贵寓见表 1)。总共粪便样品一律置于-20 ℃雪柜中保存，肌肉组织置于-80 ℃雪柜中保存，相聚外相组织均为当然风干后置于常温干燥环境下保存，血液样品加入抗凝剂后使用生物低温采样箱运载至本质室-80℃雪柜中保存。

1.2 本质体式 1.2.1 样品DNA的索要

由于在分子生物学筹商中，应用毛皮大概粪便样品为DNA 开首时，赢得的DNA 含量相对于其他组织样品较低，可能会对后续本质酿成影响致使无法赢得准确的后果，因此针对这种情况，本筹商接受重叠索要的体式，对并吞样品分别沉寂操作两次，赢得的DNA分别置于-20℃雪柜保存并用于后续本质。粪便中总DNA的索要使用粪便索要试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit，USA)。血液，毛皮及肌肉组织DNA的索要使用血液及组织索要试剂盒(QIAamp DNeasy Blood & Tissue Kit，USA)。

1.2.2 PCR扩增

狼线粒体铁心区HVR Ⅰ引物接受犬科动物mtDNA D-loop第一高变区的序列长度为582 bp通用引物对[11]:

L15404: 5′-CTCTTGCTCCACCATCAGC-3′ H16118: 5′ -AAACTATATGTCCTGAAACC-3′

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根据Cyt b里面的保守位点，选定性的扩增了位于细胞色素b后半部分长度浅显767 bp的序列，其下贱包含一段tRNApro序列。引物假想使用软件Primer 5.0及Oligo 7.5。所得引物序列为：

L14666：5′ -AGAGTGAATCTGAGGCGGCTT-3′ H15432：5′ -GCTTTGGGTGCTGATGGTGG-3′

狼铁心区HVRⅠ和Cyt b 区PCR响应体系交流: Taq 酶0.25 μL (Takara)，10 × buffer 4 μL，10 mmol/LdNTPs (Takara)3 μL，前/后引物各0.8 μL，BSA (Takara)0.25 μL，以及模板DNA 1 μL，加灭菌超纯水至50 μL。

狼铁心区第一高变区(HVR Ⅰ)PCR 响应条款为:94 ℃ 预变性4 min; 接下来40个轮回(94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 45 s)，临了72 ℃ 延迟5 min。Cyt b区PCR响应条款为:94 ℃ 预变性4 min，接下来40个轮回(94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，临了72 ℃ 延迟5 min。

1.2.3 PCR家具的回收及测序

PCR家具接受1.0%的旧例琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为5 μL PCR家具加1 μL 6×Loading Buffer(Takara)，100 V电压电泳30 min，凝胶经EB染色后置于紫外下不雅察将筹办条带切下，用凝胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，USA)回收纯化后送至北京三博远志测序公司进行测序。

1.2.4 序列分析

测序所得序列后果在Genbank上经Blast比对后笃定序列开首于狼。用Clustal X软件进行DNA序列摆列[12]，并辅以东谈主工校对，以去掉扩增的Cyt b序列中所包含的线粒体tRNApro序列。基于Kimura双参数距离模子(Kimura-2-Parameter，K2P)，通过MEGA 5.0筹办各地舆种群狼铁心区HVR Ⅰ和Cyt b序列变异碱基比例、变异类型、颐养和颠换比(R)及遗传距离等基础数据[13]。基于狼Cyt b序列，行使遗传距离和分子钟的不合时分筹办公式为t=D/2a(t为不合时分，D为遗传距离，a为分子钟)并麇集如故纠正的哺乳动物细胞色素b序列的每百万年2%分子钟来筹办中国各地筹办各地舆种群进化不合时分[14， 15]。基于狼铁心区HVR Ⅰ序列用DnaSP 5.0[16]软件辩别单倍型，将单倍型序列上传至Genbank，单倍型序列登陆号见表 4，并筹办核苷酸万般性(Nucleotide diversity，Pi)和单倍型万般性 (Haplotype diversity，Hd)，进而推算各地种群遗传万般性盘曲。为了筹商中国各地狼的系统发育，麇集本筹商中发现的中国狼线粒体HVRⅠ单倍型及从Genbank中下载已有中国狼筹商中20个mtDNA铁心区序列，然后再行辩别单倍型，用无间法 (Neighbour-joining，NJ)以 Genbank下载的郊狼线粒体铁心区序列(Canis latrans，Genank登录号：NC_008093)为外群构建单倍型的系统发生树，其中各节点的维持率根据各序列bootstrap[17]1000次重抽样后数据筹办。根据单倍型变异位点，应用软件Network 4.610 (-engineering.com/sharenet.htm)构建基于Median-Joining法勤俭汇集(Statistical parsimony network)关系图，以期与已有筹商进行比较。为了解中国狼辞寰宇界限内的系统进化地位，下载了123个寰宇各地狼线粒体铁心区单倍型(附表)，并以8个郊狼单倍型序列(附表)为外群使用NJ法构建系统发育树。

2 后果 2.1 线粒体铁心区HVRⅠ基因序列过头变异

本质赢得44个中国狼线粒体铁心区第一高变区583 bp序列，其中内蒙西旗，内蒙达赉湖当然保护区，青海湖区，青海刚察，新疆青河县样品全部扩增测序胜利(表 2)。通过比对44个线粒体铁心区HVR Ⅰ序列发现共有变异位点51个，占分析序列长度的8.76%，插入缺失位点11个，碱基替换位点40个(图 1)。筹商标明，通过扩增总DNA的体式有可能扩增出核基因组中线粒体基因插入拷贝[18， 19， 20]，即线粒体假基因(Numts)。由于线粒体假基因和线粒体基因不合度较大，这时应试虑青海种群是否存在这么的假基因。将青海种群线粒体铁心区HVR Ⅰ基因分别与Genbank中下载先前筹商的中国青海狼序列(FJ032363)以及中国内蒙狼序列(GQ374438)比对，发现青海狼与中国西藏狼序列一样度越过97.5%，而与中国内蒙狼序列比对后果与表 4后果相符，证明青海种群如实与其他种群存在较大的不合。其中颐养/颠换之比R为5.71，说明序列突变未达到迷漫现象[21]。

各地区种群的线粒体铁心区HVR Ⅰ基因碱基组身分析：A，T，C，G平均含量分别是26.29%、30.24%、16.62%和26.85%，其中A+T含量为56.53%，妥贴脊椎动物线粒体基因构成特色，低于犬科动物线粒体全序列A+T含量(60.3%—60.5%)[22]，标明HVR Ⅰ相对于其他保守的线粒体基因组区段来说较易突变。

2.2 线粒体Cyt b基因序列过头变异

本质共赢得40个狼线粒体Cyt b序列(表 2)。将扩增测序所得到40条的长度为767 bp的序列经Clustal X[2]比对去掉含有的tRNApro序列后得到582 bp的Cyt b部分序列。经分析后发现，莫得发现碱基插入及缺失餍足，标明这些Cyt b序列来自于线粒体，而不是核基因中的线粒体假基因[23]。使用MEGA 5.0分析这40条Cyt b序列发现其碱基构成为：T 29.0%、C 29.6%、A 29.9%、G 11.6%。582个碱基位点中共发现变异位点31个，占分析序列的5.33%，且变异位点全部为勤俭信息位点，未发现单核苷酸变异位点。40个个体总的颐养颠换比(R)为28.68，各地舆种群颐养颠换比均大于2.0，与动物线粒体碱基替换模式论断相符[18]。狼Cyt b部分序列G+C含量为41.2%，与脊椎动物基因序列G+C含量在40%—50%之间的论断相符[24]。密码子第一位点G+C含量(50.2%)彰着高于第二位点(40.2%)和第三位点(38.2%)的含量，标明密码子第二三位点初始倾向于富含AT(表 3)。

2.3 基于线粒体铁心区HVR Ⅰ中国部分地区狼遗传万般性分析

使用软件DnaSP 5.0对44个胜利赢得筹办个体样本片断序列进行分析，共笃定16个单倍型，其中青海种群里面青海刚察与青海湖区种群分享3个单倍型(QH2，QH3，QH4)，新疆种群里面新疆阿勒泰地区及青河县种群分享1个单倍型XJ2，内蒙种群里面内蒙达赖湖当然保护区，西旗及呼伦贝尔种群分享2个单倍型NM2和NM4，吉林图门与内蒙呼伦贝尔种群分享1个单倍型NM3(表 4)。吉林图门与内蒙呼伦贝尔种群之间分享1个单倍群，说明两个种群之间阐发为共同的母系开首或存在基因交流。

由于吉林图门种群数目小于3，不妥贴Tajima 历练[25]要求至少3条同源原序列的要求，是以及第妥贴条款的青海，内蒙和新疆种群进行遗传万般性分析。使用DnaSP 5.0软件对散布在中国青海、内蒙、新疆3个种群44个个体测得的线粒体铁心区HVR Ⅰ进行遗传分析后得出，中国种群单倍型多态性Hd为0.897，核苷酸多态性Pi为0.02278。新疆种群的核苷酸万般性为0.942，彰着的高于另外两个种群，说明新疆种群遗传万般性较高，遗传资源丰富。通过Tajima′s D 和Fu and Li′s D 值检测后果无权贵各别(P＞0.10)标明这3个中国狼种群相对于中性进化的歧异度莫得彰着的偏离(表 5)。

从Genbank下载的中国各地区的基于线粒体铁心区序列20个灰狼的线粒体铁心区序列(附表)。由于下载的序列长度存在各别，是以咱们将总共序列裁剪后得到长度为582 bp的线粒体铁心区序列。基于582 bp的序列再行辩别中国狼单倍型，发现28个单倍型，并再行对其进行编号，其中NM2(W2)，NM4 (W4)，QH2 (W7)，QH3 (W8)，QH4 (W9)，XJ3 (W16)与往常筹商中发现的单倍型王人备匹配(附表)。

2.4 分子系统树的构建

通过对Genbank下载的20条中国狼线粒体铁心区序列与比筹商发现的单倍型对后再行界说28个单倍型。通过比对后发现本筹商发现的线粒体铁心区单倍型与Tsuda，K等[26]在蒙古乌兰巴托隔邻发现的狼单倍型分享3个单倍型，与罗理杨[7]等发现的单倍型分享4个单倍型(附表)。使用NJ法构建28个中国狼单倍型系统进化树(图 2)，除青海种群外，其他地区或亚地区的的狼单倍型并莫得麇集在全部，标明地区或亚地区狼在遗传学方面莫得独有的遗传结构[7]。通过进化树不出丑出，青海种群单倍型与除青藏高原外的单倍型基于遗传距离分属两个不同的世系，这与罗理杨等所得的后果一致[7]。把得到的28个中国狼单倍型与Genbank高下载的123个灰狼单倍型序列构建NJ树发现，位于青藏高原过头左近地区的狼与喜马拉雅山脉西侧的印度狼亲缘关系较近并为一支，而广布于中国其他地区的狼单倍型与欧亚狼亲缘关系较近，且莫得阐发出彰着的与地舆散布联系的各别(图 3)。

2.5 分化时分测度

基于Cyt b序列，行使如故纠正的哺乳动物细胞色素b序列的每百万年2%分子钟来筹办中国各地狼进化不合时分。基于Kimura双参数距离模子，筹办中国各地狼的遗传距离，其中内蒙、新疆与吉林种群遗传距离数值界限为0.002—0.006 MYA Bp，其种群不合时分浅显为0.05—0.15 MYA Bp。青海狼与本筹商其他地舆种群遗传距离较远，遗传距离为0.043—0.048，由此得出青海种群与其他地舆种群不合时分浅显在1.08—1.2 MYA Bp，刚巧的是这与青藏高原受地质作用的急速杰出时分(0.9—1.1 MY)相近[27]。

3 计划

狼散布界限广，旷野活体采样难度很大。本文尝试从粪便中胜利的索要总DNA，为今后通过使用粪便样品对狼进行遗传进化筹商提供了依据。本筹商从55个样品中胜利的索要和扩增出出44个个体的线粒体HVR Ⅰ和40个Cyt b序列，其中未胜利索要出DNA的样品全部为粪便样品，而且主要为内蒙呼伦贝尔地区样品。未索要出来的原因可能是相聚的粪便样品时分过长，样品中的DNA降解大概粪便样品中含有可阻挠后续响应的酶[28]。

对种群进行遗传万般性评估，不仅有意于了解种群结构及动态，而且为制定种群保护和处理步调提供依据。经常研讨一个种群遗传万般的盘曲主若是通过对比种群里面单倍型间的遗传距离和核苷酸多态性，关联词由于核苷酸多态性充分研讨到了单倍型在种群内的比例，是以一般使用核苷酸多态性来估量一个种群遗传万般性的盘曲[29]。本筹商行使线粒体HVR Ⅰ序列对中国4个地舆狼种群进行遗传万般性检测，发现平均核苷酸多态性为2.27%，与寰宇其他地区狼比较遗传万般性是较高的，如Randi等[30]通过分析mtDNA铁心区序列发现保加利亚狼核苷酸万般性为0.26%，Pilot[31]等在东欧十多个国度相聚到643只狼样品，并胜利地坚定出21个线粒体DNA单倍型，得出其核苷酸万般性为1.7%，Tomislav等[32]分析了91只狼的线粒体铁心区序列得出克罗地亚狼遗传万般性为1.8%，从而说明中国狼相对于寰宇其他国度和地区来说线粒体D-loop区存在丰富的万般性。

通过构建的中国狼分子系统发育树不错看出，青海种群与西藏狼彰着的并为一支，而其他地区的狼则莫得按照地舆区画分红不同的谱系，同期各个谱系间含有共同的单倍型，说明其遗传基础一致，存在着基因交流，这与北好意思狼亚种分化的筹商是一致的[33]。t历练也表示了吉林，内蒙，新疆种群之间的遗传距离无权贵各别，而与青海种群各别彰着。其中青海种群领有较多的单倍型，且通过寰宇狼系统进化树不出丑出，青海种群领有的单倍型较为相当，不与除青藏高原及左近地区外的中国其他地区的狼单倍型一样，而是与喜马拉雅山山脉西部位于印度等国度地区的狼接近，通过青海种群的散布区域研讨，青海种群位于青藏高原东北部的青海湖左近地区，北面为昆仑山和祁连山，东面为横断山脉，平均海拔在3000m以上，平地不错达到4000m以上，这些自然的地舆樊篱贫乏了青海种群与青藏高原外的其他地舆种群进行基因交流，遥远的地舆远离酿成青海种群沉寂进化形成了远离种群。而青海种群与西藏狼，云南狼分享单倍型，说明了青海种群与西藏云南种群在发源进化上关系比较近。

长久以来，筹商以为中国狼只消一个亚种即C.l.Chanco[4， 5]。Tsuda K等[26]通过筹商狼的3个亚种(C. l. lupus，C. l. pallipes and C. l. Chanco) 发现中国狼(C. l. Chanco)的线粒体铁心区变异较其他两个亚种较大，而咱们通过对比线粒体铁心区部分序列发现，除青海地区序列与另外两个亚种序列各别较大外，其他地区种群单倍型与另外两个亚种判袂不大。Ramesh K Aggarwal 等[34]行使Tsuda K 等[26]从蒙古国乌兰巴托发现的狼的线粒体单倍型与印度西部喜马拉雅山脉狼进行比较，得出印度西部喜马拉雅山脉狼是与蒙古狼是王人备不同的，并推测其是寰宇上最陈旧的狼世系，这与的筹商后果一致。基于线粒体DNA的筹商后果，Dinesh等[35]以为不错将位于印度喜马拉雅山脉隔邻狼种群从中国狼或蒙古狼亚种(C. l. Chanco)中剥离出来全部划归为西藏亚种(C. l. langier)。通过本文筹商，并麇集往常花样学及剖解学上的筹商后果[36]推测青藏高原种群的狼可能与印度喜马拉雅山隔邻的狼同属于西藏狼亚种(C. l. langier)，虽然这仅仅推测，具体的情况还需要从剖解生理学，基因组学乃至古生物学的把柄来阐明。同期通过构建的系统进化树(图 3)也能看到除青藏高原及左近地区的狼外中国其他地区的狼单倍型广布于欧亚大陆乃至北好意思大陆狼分支中，说明这些地区的狼发源进化关系较为复杂。

4 论断

基于线粒体铁心区部分序列测定及分析，筹商后果标明中国狼较寰宇其他国度地区领有较高的遗传万般性。系统进化分析标明中国狼不错分为两个世系，且位于青藏高原过头左近地区的狼与中国其他地区的狼遗传结构各别较大文爱 x，且其遗传万般性较其他地区低。推测其在进化上与中国其他地区狼较早出现不合，并形成沉寂进化种群。行使线粒体Cyt b部分序列推算各地舆种群的进化不合时分得出，位于青藏高原种群与其他地舆种群不合时分浅显在1.1 MY前，与青藏高原受地质作用急速杰出时分相近。

致谢： 中国科学院西北高原生物所、青海动物园、哈尔滨野狼湖狼园、新疆富疆狼园、内蒙古达赉湖当然保护区提供筹商样品，东北林业大学高中信西席、曲阜师范大学刘广帅同学为相聚样品提供指示与匡助，特此致谢。